目前，使用嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞進(jìn)行治療已成為治療某些血液系統(tǒng)腫瘤患者的有力工具。然而，所有FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞療法均基于從患者身上分離的自體T細(xì)胞，盡管有顯著的臨床效果，該策略仍有幾個(gè)重要的局限性，即治療成本非常高，個(gè)別生產(chǎn)過程可能存在問題。

與使用自體CAR-T細(xì)胞的治療相比，由同種異體供體材料產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞具有三個(gè)主要優(yōu)勢。首先，根據(jù)個(gè)體患者的既定治療方案，可以提前生產(chǎn)同種異體CAR-T細(xì)胞，并毫不延遲地交付。其次，異基因供體來源的T細(xì)胞不會暴露于多輪抗白血病治療中，因此它們更容易接受體外操作。第三，一小部分患者最終可能永遠(yuǎn)無法獲得質(zhì)量良好、數(shù)量有治療意義的自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。

目前，已有多項(xiàng)異基因CAR-T細(xì)胞療法進(jìn)入臨床階段，其中一些臨床試驗(yàn)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，可能為更多更廣泛的患者帶來福音。

同種異體CAR-T細(xì)胞可以并且應(yīng)該代替自體CAR-T細(xì)胞或與自體CAR-T細(xì)胞結(jié)合使用時(shí)，有幾種情況：i）有阻礙自體產(chǎn)品制造的物流問題；ii）制造失敗，其中同種異體產(chǎn)品可以替代自體產(chǎn)品，而不會延遲計(jì)劃的輸注；iii）當(dāng)自體產(chǎn)品在患者體內(nèi)無法擴(kuò)增時(shí)，輸注同種異體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品；iv）由于患者的T細(xì)胞數(shù)量較低和/或疾病進(jìn)展迅速，無法預(yù)先制造自體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品；v） 異基因CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品通過設(shè)計(jì)成為造血干細(xì)胞移植的橋梁。

盡管使用同種異體CAR-T細(xì)胞進(jìn)行治療有許多優(yōu)點(diǎn)，但這種技術(shù)有兩個(gè)主要缺點(diǎn)。首先，受者的細(xì)胞對所給予CAR-T細(xì)胞的天然T細(xì)胞受體（TCR）可能誘導(dǎo)其激活并導(dǎo)致急性移植物抗宿主病（GvHD）。其次，CAR-T細(xì)胞對宿主免疫系統(tǒng)是外來的，這可能會導(dǎo)致它們迅速從循環(huán)中清除。

因此，異基因CAR-T細(xì)胞的制造主要是通過各種手段破壞CAR-T細(xì)胞的TCR和MHC-1分子。破壞TCR可以通過三種不同的方式進(jìn)行：抑制蛋白的表達(dá)；通過使用TALENS或CRISPR/Cas9敲除編碼TCR鏈的基因；通過shRNA介導(dǎo)mRNA的沉默。

上面的方法均不能從細(xì)胞群中100%的去除TCR。因此，剩余TCR+細(xì)胞的額外消耗是制造同種異體CAR-T細(xì)胞的一個(gè)重要部分，這在很大程度上決定了GvHD的發(fā)生和治療效果。消除TCR +細(xì)胞的方法是基于CliniMACS™的裝置。簡言之，在引入CAR和TCR消除后，首先用生物素化的抗TCR抗體孵育T細(xì)胞，然后用與磁性微球結(jié)合的抗生物素抗體孵育T細(xì)胞。隨后，殘留的TCR+細(xì)胞被CliniMACS清除。

此外，為了增加異基因CAR-T細(xì)胞的持久性，可以考慮通過基因敲除免疫排斥的關(guān)鍵介質(zhì)MHC-I分子，這可以通過破壞編碼β-微球蛋白的基因來實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，同種異體CAR-T細(xì)胞清除腫瘤細(xì)胞的能力取決于初始擴(kuò)增、持續(xù)時(shí)間、GvHD的發(fā)生以及宿主免疫系統(tǒng)排斥這些細(xì)胞的能力。在制定管理異基因CAR-T細(xì)胞的策略時(shí)，可以選擇不同來源的細(xì)胞及細(xì)胞亞群。

αβT細(xì)胞

用于制造同種異體CAR-T細(xì)胞的T細(xì)胞主要來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞，尤其是具有由α和β鏈組成的TCR的細(xì)胞，其構(gòu)成健康供體循環(huán)T細(xì)胞的約90%。由于αβT細(xì)胞在外周血中的相對豐度和快速增殖的能力，它是制造同種異體CAR-T細(xì)胞的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。然而，該細(xì)胞亞群在急性和慢性GvHD的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。因此，需要通過基因編輯手段破壞TCR，以減少發(fā)生GvHD的風(fēng)險(xiǎn)。

病毒特異性T細(xì)胞

除了基因編輯方法外，減輕GvHD的策略之一是使用基于病毒特異性T細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞，這些細(xì)胞結(jié)合了CAR的抗腫瘤活性和降低GvHD風(fēng)險(xiǎn)。GvHD風(fēng)險(xiǎn)與TCR多樣性相對應(yīng)，因此，輸注病毒特異性記憶T細(xì)胞后GvHD減少可能是由于病毒特異性記憶T細(xì)胞中TCR的功能受到限制。此外，這種策略的一個(gè)可能的不足是初始病毒特異性記憶T細(xì)胞的數(shù)量較低。

γδT細(xì)胞

供體來源的γδT細(xì)胞通過利用其固有受體以不依賴于MHC分子的方式識別多種腫瘤抗原，并且可以在沒有TCR清除的同種異體環(huán)境中應(yīng)用。此外，一旦激活，它們可以通過促進(jìn)其他免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而產(chǎn)生進(jìn)一步的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用于CAR-T具有顯著的優(yōu)勢：iPSC具有自我更新能力，能夠在體外長期培養(yǎng)，可以在體外進(jìn)行各種復(fù)雜和精確的基因改造；iPSC具有分化為人體所有細(xì)胞類型的能力，可產(chǎn)生大量的功能性T細(xì)胞。盡管存在一些限制，但I(xiàn)PSC仍具有均勻和大規(guī)模生產(chǎn)的CAR-T細(xì)胞的潛力。

NK細(xì)胞

異基因NK細(xì)胞對于過繼性細(xì)胞治療（ACT）是相當(dāng)安全的，因?yàn)樗鼈兺ǔ２唤閷?dǎo)發(fā)生GVHD。此外，NK細(xì)胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF，不產(chǎn)生啟動CRS的IL-1和IL-6。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細(xì)胞外，NK細(xì)胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細(xì)胞，例如自然細(xì)胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。最后，NK細(xì)胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細(xì)胞（HESC）、iPSC甚至NK-92細(xì)胞系中產(chǎn)生。

ALLO-715抗BCMACAR-T細(xì)胞（NCT04093596）

這是一項(xiàng)1期臨床試驗(yàn)，招募患有r/r多發(fā)性骨髓瘤患者。截至2020年10月，共有31名患者納入安全人群。療效人群包括26名患者，分為四個(gè)劑量水平的細(xì)胞（40、160、320和480×10⁶），平均隨訪時(shí)間為3.2個(gè)月。

ALLO-715的CAR-T細(xì)胞受體包括具有4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的單鏈可變抗BCMA片段。為了防止移植物排斥反應(yīng)，并在不影響ALLO-715 CAR-T細(xì)胞的情況下允許選擇性淋巴細(xì)胞耗竭，引入了CD52和TRAC的KOs。

26名患者的所有劑量組和淋巴清除方案的總有效率（ORR）為42%（11/26）。在接受320×106細(xì)胞ALLO-715治療的10名患者中觀察到了*的抗癌活性。對于該隊(duì)列，ORR為60%（6/10），其中4名患者（40%）觀察到非常好的部分響應(yīng)。

在45%（14/31）患者中報(bào)告了CRS。一名患者在ALLO-715輸注后一天出現(xiàn)非中性粒細(xì)胞減少性發(fā)熱和多灶性肺炎，一次5級發(fā)作導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡。研究認(rèn)為這一事件與進(jìn)行性骨髓瘤以及環(huán)磷酰胺和ALLO-647預(yù)處理方案有關(guān)。研究報(bào)告，42%（13/31）患者在治療期間出現(xiàn)了感染性疾病，其中13%的患者出現(xiàn)了3級感染。未觀察到GvHD或ICAN病例。

ALLO-501抗CD19CAR-T細(xì)胞（NCT03939026）

ALLO-501是一項(xiàng)針對復(fù)發(fā)/難治性非霍奇金淋巴瘤（r/r NHL）患者的I期臨床試驗(yàn)，ALLO-501CAR-T基于小鼠CD19特異性單鏈抗體（4G7）。截至2021年4月19日，41例患者接受了ALLO-501治療，有效人群包括32例患者，共三個(gè)劑量組（40, 120和360×10⁶）。治療包括先前的淋巴清除，包括使用氟達(dá)拉濱加環(huán)磷酰胺和ALLO-647。

結(jié)果顯示，整體ORR為75%（24/32），50%（16/32）*緩解（CR）。研究報(bào)告11例（27%）患者出現(xiàn)輕度至中度CRS，1例（2%）出現(xiàn)3級神經(jīng)毒性，登記患者中無GvHD。感染率為61%（25/41），與使用自體CAR-T細(xì)胞的試驗(yàn)中觀察到的感染率相似。

UCART19抗CD19CAR-T細(xì)胞

UCART19是一種基于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR19并使用TRAC/CD52特異性TALENs的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。TALENs用于在編碼TCR和CD52α恒定鏈的基因中引入KOs，以最小化GvHD風(fēng)險(xiǎn)。用磁珠去除殘留的TCR+細(xì)胞后，只有0.7%的細(xì)胞具有可檢測的細(xì)胞表面TCR。

在7名兒童的PALL試驗(yàn)和14名成人的CALM試驗(yàn)中，評估了UCART19的安全性和有效性。患者必須有CD19+B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的證據(jù)，在UCART19輸注前，所有患者均進(jìn)行了淋巴清除：17名患者（81%）給予了氟達(dá)拉濱、環(huán)磷酰胺和alemtuzumab，4名患者（19%）給予了氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺。

PALL試驗(yàn)中的兒童接受UCART19（1.1–2.3×10⁶/kg），CALM試驗(yàn)包括劑量遞增階段（6×10⁶細(xì)胞、6–8×10⁷細(xì)胞或1.8–2.4×10⁸細(xì)胞）。全體患者和接受含alemtuzumab的淋巴清除患者的ORR分別為67%（14/21）和82%（14/17）。14名患者中有10名（71%）獲得*緩解，并繼續(xù)進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植（HSCT）。研究報(bào)告，在2019年8月的數(shù)據(jù)截止日期，14名獲得響應(yīng)的患者中有10名（71%）隨后復(fù)發(fā)或死亡。6個(gè)月時(shí)無進(jìn)展生存率為27%。

UCART19觀察到的副作用似乎與報(bào)道的自體抗D19 CAR-T細(xì)胞的副作用相似。CRS是UCART19治療最常見的不良事件（91%的患者），等級≥3的CRS出現(xiàn)在三名患者中。只有兩名患者（10%）在UCART19輸注后出現(xiàn)1級GvHD。

CTX110抗CD19CAR-T細(xì)胞（NCT04035434）

UCART19和其他CAR-T細(xì)胞使用隨機(jī)整合的病毒將編碼CAR結(jié)構(gòu)的基因傳遞給T細(xì)胞DNA。CRISPR Therapeutics使用CRISPR/Cas9將CAR結(jié)構(gòu)精確插入TRAC位點(diǎn)。CTX110是使用該技術(shù)靶向CD19+B細(xì)胞惡性腫瘤的CAR-T細(xì)胞。

目前，正在進(jìn)行的1期CARBON臨床試驗(yàn)評估了CTX110在11例患有r/r NHL患者中的安全性和有效性。11名患者在使用氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除后，以四種劑量水平（30、100、300或600×10⁶）輸注CTX110細(xì)胞。

結(jié)果顯示，在30–300×10⁶ 劑量組中，沒報(bào)告有GvHD病例。其它不良反應(yīng)包括3例等級≤2的CRS（30%）和1例2級ICAN（10%）。36%（4/11）的患者獲得CR。

PBCAR0191抗CD19CAR-T細(xì)胞（NCT03666000）

Precision BioSciences公司的同種異體產(chǎn)品PBCAR0191使用了基于I-CreI歸巢內(nèi)切酶的通用基因組編輯平臺ARCUS，將CD19特異性CAR插入TRAC位點(diǎn)。I期臨床研究的初步數(shù)據(jù)顯示， 27例患者（16例為r/r NHL，11例為r/r B-ALL）中，所有劑量組的ORR和CR分別為55%（15/27）和37%（10/27）。

最近，另一項(xiàng)研究報(bào)告了PBCAR0191高劑量（3×10⁶個(gè)細(xì)胞）并伴有增強(qiáng)淋巴清除（氟達(dá)拉濱加環(huán)磷酰胺）的患者隊(duì)列的臨床結(jié)果。試驗(yàn)共納入21例患者，包括16例非霍奇金淋巴瘤患者和5例B-ALL患者，對其中13例NHL患者和5例ALL患者的治療效果進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，ORR為83%（15/18），CR為66%（12/18）。大多數(shù)不良事件是輕微的，在1例NHL患者中觀察到ICANS 3級，在31%（5/16）NHL患者中觀察到3級感染，在80%（4/5）B-ALL患者中觀察到3級感染，未觀察到GvHD的證據(jù)。

CYAD-101（NCT03692429）

CYAD-101是由Celyad Oncology開發(fā)的一款基于NKG2D受體和TCR抑制分子（TIM）的非基因編輯同種異體CAR-T細(xì)胞。NKG2D受體可以識別表達(dá)在大多數(shù)實(shí)體瘤和血癌細(xì)胞表面的8種不同的配體，使其可以同時(shí)靶向多種不同的癌癥；TIM旨在消除負(fù)責(zé)GvHD的免疫反應(yīng)，從而避免GvHD。

CYAD-101在不可切除轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的alloSHRINK I期研究中進(jìn)行了評估。在標(biāo)準(zhǔn)預(yù)處理化療（FOLFOX）后，15名患者接受三種劑量水平中的一種（每次輸注1×10⁸、3×10⁸或1×10⁹細(xì)胞）。研究沒有報(bào)告劑量限制性毒性或GvHD。在15名患者中，2名（13%）患者獲得部分緩解（PR），9名（60%）患者病情穩(wěn)定（SD）。

CIK抗CD19細(xì)胞（NCT03389035）

有研究提出了一種基于“睡美人"轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的異基因CAR-T細(xì)胞，用CARs產(chǎn)生CIK細(xì)胞。根據(jù)CIK細(xì)胞方案，刺激細(xì)胞分化為記憶T細(xì)胞亞群。在多中心臨床研究中（NCT03389035），對13例HSCT后復(fù)發(fā)的B-ALL患者使用CARCIK-CD19細(xì)胞。研究沒有報(bào)告ICANS或GvHD病例，嚴(yán)重不良事件是接受最高劑量治療患者出現(xiàn)的兩例1級和2級CRS。61.5%的患者出現(xiàn)*緩解，而在接受兩種最高劑量的6名患者中，85.7%的患者出現(xiàn)*緩解。

ATA188（NCT03283826）

ATA188是一款由Atara公司開發(fā)的異基因EBV特異性T細(xì)胞免疫療法。在針對多發(fā)性硬化癥的的I期試驗(yàn)中評估了ATA188這種EBV特異性T細(xì)胞亞群的初步療效和安全性。結(jié)果顯示，在輸注ATA188細(xì)胞后無GvHD或CRS的記錄，進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥患者對ATA188耐受性良好，未見劑量限制性毒性。

Vγ9Vδ2 T細(xì)胞

異基因Vγ9Vδ2 T細(xì)胞治療在晚期惡性肝癌（NCT03183232）、肺癌（NCT03183219）、胰腺癌（NCT03183206）或乳腺癌（NCT03180437）中進(jìn)行了臨床評估。輸注異基因Vγ9Vδ2 T細(xì)胞后未報(bào)告重大不良事件（CRS、GvHD）。

NK細(xì)胞

關(guān)于工程化異基因CAR-NK細(xì)胞，有研究報(bào)告了一期和二期試驗(yàn)的結(jié)果，其中11名r/r NHL或CLL患者接受了來自臍血的HLA不匹配的抗CD19 CAR-NK細(xì)胞治療。研究沒有報(bào)告CRS、ICAN和GvHD，所有患者都有可逆的血液毒性事件，主要與淋巴細(xì)胞清除有關(guān)。在平均13.8個(gè)月的隨訪中，7名患者（64%）*緩解。

在完成的針對AML患者靶向CD33的CAR-NK-92試驗(yàn)中，在輸注CD33-CAR NK-92細(xì)胞后僅有兩例I級CRS，無GvHD病例。然而，不幸的是，兩名患者復(fù)發(fā)，一名患者對治療無反應(yīng)。

顯然，使用來自健康捐贈者的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品是有利的，因?yàn)樗鼘颊叩拿庖郀顟B(tài)依賴性較小，更標(biāo)準(zhǔn)化，并且由于生產(chǎn)成本較低，大大擴(kuò)大了患者獲得治療的機(jī)會。此外，還必須考慮到，在疾病迅速發(fā)展時(shí)，自體CAR-T細(xì)胞制造所需的時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵因素；另外，一小部分患者可能永遠(yuǎn)無法獲得數(shù)量、質(zhì)量良好的自體CAR-T細(xì)胞。

然而，異基因CAR-T細(xì)胞可能導(dǎo)致GvHD，并且自身可能被受體的免疫系統(tǒng)排斥。此外，與自體CAR-T細(xì)胞相比，同種異體CAR-T細(xì)胞的療效和應(yīng)答率較低，這在很大程度上歸因于其較低的持久性。但從長遠(yuǎn)來看，這也可能是一種安全優(yōu)勢。

目前，多項(xiàng)研究正在臨床中檢驗(yàn)不同靶點(diǎn)和不同技術(shù)平臺開發(fā)的異基因CAR-T細(xì)胞療法，隨著現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)一步成熟和新技術(shù)的開發(fā)，相信異基因CAR-T細(xì)胞療法終將會使更多的腫瘤患者受益。

參考文獻(xiàn)：

1.Strategies to Circumvent the Side-Effects of Immunotherapy Using Allogeneic CAR-T Cells and Boost Its Efficacy: Resultsof Recent Clinical Trials. Front Immunol. 2021; 12: 780145.